Oxiracetam (Оксирацетам)

Что такое оксирацетам?

Оксирацетам / Oxiracetam (4-гидрокси-2-он-1 пирролидин ацетамид) – ноотропное соединение из семейства рацетамов, известное своей способностью напрямую воздействовать на гиппокамп и кору головного мозга, проходя через гематоэнцефалический барьер. Оксирацетам считается относительно более безопасным и хорошо переносимым, учитывая, что ноотроп не влияет на сосудистую активность и не проявляет никакой возбудимости центральной нервной системы. При этом текущие исследования этого соединения сосредоточены на его нейропротекторных качествах, которые могут быть использованы для улучшения нарушенной когнитивной функции и клинических результатов нескольких расстройств ЦНС и нейродегенеративных заболеваний [2].

Основные результаты исследования

1) Было обнаружено, что применение оксирацетама потенциально способствует улучшению нейровоспаления и восстановлению когнитивных нарушений в случаях черепно-мозговой травмы (ЧМТ).

2) Лечение оксирацетамом способствует реализации нейропротекторных эффектов путем регулирования активности микроглии у мышей, перенесших неонатальное повреждение мозга вследствие гипоксии и ишемии.

Избранные данные

1) При черепно-мозговой травме когнитивные нарушения часто рассматриваются как побочный эффект и, как было показано, достигают 49% пациентов в подострой фазе и 54% в хронической фазе. Хотя препарат донепезил иногда назначают пациентам со значительными когнитивными нарушениями, лечения нарушений после черепно-мозговой травмы не существует. При этом текущие исследования были сосредоточены на ноотропе оксирацетаме из-за его потенциала улучшать исполнительные функции и память за счет усиления гиппокампальной протеинкиназы C (PKC) и усиления активности индуцированного K+ ацетилхолина и холинацетилтрансферазы. Исследователи смогли сделать вывод, что нейровоспаление, которое возникает после черепно-мозговой травмы, напрямую влияет на когнитивную функцию. При этом исследовательская группа Youn et al наблюдала потенциальные способности оксирацетама смягчать чрезмерное нейровоспаление для восстановления нормального когнитивного функционирования [1].

Модели in vitro и in vivo для демонстрации эффектов оксирацетама на когнитивные функции после черепно-мозговой травмы. с использованием среды Ham’s F12/Minimum Essential Medium клетки SH-SY5Y были введены и выращены до 80-90% слияния в шестилуночных культуральных планшетах BioFlex. После достижения 80-90% слияния клетки инкубировали в соотношении 1:1 среды Ham’s F12/Minimum Essential Medium. Для индукции модели исследователь использовал систему Cell Injury Controller II с длительностью импульса 50 мс и давлением регулятора 3,5 мс.

Затем все клетки были случайным образом разделены на три группы: контроль, TBI без лечения и TBI, обработанные 100 мМ оксирацетама; эта доза была определена с помощью анализа CCK-8. После периода культивирования клетки были подвергнуты количественному анализу полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) для оценки экспрессии мРНК SOD1, SOD3, TNF-альфа, IL-1, IL-10 и IL-1beta. За qRT-PCR последовало выполнение анализа вестерн-блоттинга для измерения экспрессии COD-2, NACHT, LRR и NLRP3, каспазы-1 и IL-1beta. Наконец, окрашивание DCF-DA и концевая маркировка терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP также имели место для изучения продукции внутриклеточных активных форм кислорода и уровня присутствующих апоптотических клеток [1].

Для части исследования in vivo исследовательская группа использовала самцов мышей C57BL/6 J в возрасте семи или восьми недель. Животных содержали в стандартных условиях, включая 12-часовой цикл темноты/света, а также пищу и воду, предоставляемые ad libitum. Подобно части исследования in vitro, мышей случайным образом разделили на три группы, включая: ложную операцию, ЧМТ без лечения и ЧМТ с лечением оксирацетамом. ЧМТ вызывали у мышей с помощью стереотаксического импактора, после чего мышей помещали в стереотаксическую рамку под 2,5% анестезией изофлураном. Скальпы обнажали, и ЧМТ создавали с помощью 2-миллиметрового тупого наконечника, помещенного на глубину 2,0 мм, -2,0 мм в медиальном/латеральном направлении и -2,0 мм в передне-заднем направлении. [1]

После индукции черепно-мозговой травмы или ложной операции оксирацетам вводили внутрибрюшинно экспериментальной группе в дозах 30 мг/кг/день в течение периода лечения 5 дней. Чтобы снизить риск смещения на протяжении всего исследования, только исследователи, которые были не осведомлены о протоколе лечения, оценивали результаты. Чтобы наблюдать эффекты ноотропа у испытуемых, участвовавших в исследовании in vitro, были проведены три различных когнитивных теста, включая: распознавание новых объектов, Y-образный лабиринт и водный лабиринт Морриса. Тесты записывались с помощью системы видеоотслеживания и анализировались с помощью теплового картирования, где красный цвет представлял часто посещаемые области, а синий – менее посещаемые области [1].

2) Гипоксические и ишемические состояния в мозге приводят к клеточному некрозу и разжижению тканей, что в конечном итоге приводит к воспалению, которое еще больше усиливает ухудшение мозговой ткани и расширение ядра инфаркта. Если лечение не проводится своевременно, область восстанавливаемой ткани, которая окружает ядро инфаркта, склонна к расширению, что приводит к вторичным нарушениям и потенциальному включению в ядро, что приводит к расширению инфаркта. При этом исследовательская группа Ван и др. изучила влияние лечения оксирацетамом на восстановление после повреждения нейронов, вызванного гипоксией, ишемией и последующим воспалительным каскадом, а также активацию микроглии в области мозга.

Исследовательская группа использовала самцов мышей KM, которые были 7 дней после рождения для своих экспериментальных целей. Испытуемые были случайным образом распределены по 4 экспериментальным группам, включая: 1) ложную группу, леченную физиологическим раствором, 2) мышей, перенесших инсульт гипоксии-ишемии, 3) мышей, перенесших инсульт и леченных 1,0 мг/кг оксирацетама, и 4) мышей, перенесших инсульт и леченных 10,0 мг/кг оксирацетама. Мыши были анестезированы посредством вдыхания газа изофлурана, в то время как препаровальный микроскоп использовался для выполнения постоянной перевязки правой сонной артерии [2].

После процедуры испытуемых помещали в камеру восстановления на 60 минут, после чего подвергали воздействию гипоксических условий (увлажненный 8% O2 + 5% CO2 + 87% N2) в течение 90 минут; мыши в контрольной группе подвергались анестезии и только разрезу шеи. Первая доза оксирацетама в физиологическом растворе вводилась внутрибрюшинно через 6 часов после гипоксически-ишемического инсульта. Введение дозировки продолжалось в течение 3 дней, после чего проводилась эвтаназия мышей для дальнейшего анализа мозговой ткани.

Перед тем, как животных усыпили, на мышах были проведены три различных теста на поведенческие рефлексы, включая тест на рефлекс выпрямления, тест на отрицательный рефлекс геотаксиса и тест на рефлекс избегания обрыва. Тест на рефлекс выпрямления включает в себя размещение мышей на спине на горизонтальной поверхности стола, в то время как исследователи регистрируют, сколько времени требуется каждой группе мышей, чтобы приземлиться на все четыре конечности после переворачивания. Максимально допустимое время составляло 1 минуту, и каждую мышь тестировали 3 раза. Тест на отрицательный рефлекс геотаксиса включает в себя размещение каждой мыши в середине грубой доски шириной 30 см под наклоном 25 градусов головой вниз, в то время как исследователи регистрируют время, которое требуется каждой группе мышей, чтобы повернуться на 180 градусов и спуститься с доски. Максимально допустимое время составляло 3 минуты, и каждую мышь тестировали 3 раза. Наконец, тест на рефлекс избегания обрыва включал размещение мышей на краю платформы так, чтобы их передние лапы и нос высовывались за край, в то время как исследователи регистрировали время, которое требовалось каждой группе мышей, чтобы отойти от стола на расстояние более 1 см [2].

После проведения поведенческого рефлекс-тестирования были выполнены МРТ-сканирования для определения степени инфаркта; животные были анестезированы посредством ингаляции изофлурана и сканировались в течение 0,5 часа. После завершения МРТ животные были подвергнуты эвтаназии, а мозговая ткань была собрана, и был выполнен расчет содержания воды в мозге с помощью метода сухого-влажного веса. Затем измерялось отношение инфаркта с помощью методов измерения инфаркта TTC. Мозговые ткани были разрезаны на срезы толщиной 1 мм и инкубированы в 2% TTC в течение 10 минут, после чего срезы были зафиксированы в 4% параформальдегиде в течение 24 часов [2].

Для оценки активации микроглии в области восстанавливаемого повреждения были приготовлены первичные культуры клеток микроглии путем переваривания образцов коры головного мозга в 0,25% трипсине ЭДТА в течение 20 минут с последующим прекращением переваривания в DMEM, содержащей 10% сыворотки плода быка, пенициллин и стрептомицин. Полученный продукт был отфильтрован, ресуспендирован в среде и высеян в колбы, которые поддерживались в течение 8-10 дней до отделения клеток микроглии. Клетки образцов были высеяны на 6-луночные планшеты в течение 2-3 дней, а затем собраны для экспериментальной модели кислородно-глюкозной депривации.

Как первичные клетки микроглии, так и клетки HT-22 использовались для модели кислородно-глюкозной депривации и первоначально промывались PBS с последующей инкубацией в среде с низким содержанием глюкозы. Затем все клетки были случайным образом распределены в одну из пяти экспериментальных групп, включая: 1) контроль, 2) кислородно-глюкозная депривация, 3) кислородно-глюкозная депривация с введением 50 нмоль/мл оксирацетама, 4) кислородно-глюкозная депривация с введением 100 нмоль/мл оксирацетама и 5) кислородно-глюкозная депривация с введением 200 нмоль/мл оксирацетама. Клетки HT-22 и первичные клетки микроглии были далее разделены на 5 подгрупп по временным точкам, включая: 0 часов, 3 часа, 6 часов, 9 часов и 12 часов). Затем клетки высевали в культуральные планшеты и инкубировали для анализа пролиферации клеток с помощью анализа CCK-8, чтобы наблюдать, как лечение оксирацетамом влияет на клетки, инкубированные в среде с низким содержанием глюкозы. Кроме того, РНК клеток микроглии, обработанных средой с низким содержанием глюкозы с обработкой ноотропом или без нее, были извлечены и подготовлены для проверки качества РНК [2].

Обсуждение

1) Результаты анализа CCK-8, в которых использовалась часть эксперимента in vivo, проведенного исследовательской группой Youn et al, показали, что не было существенной разницы в жизнеспособности клеток, обработанных менее чем 100 нМ ноотропа, оксирацетама. При этом дозы оксирацетама 100 нМ и выше показали, что ноотроп вызывал более высокую экспрессию SOD1 и SOD2, одновременно снижая уровни TNF-альфа, IL-6, IL-10, COX-2, NLRP3, каспазы-1 и IL-1 бета мРНК и белков. Кроме того, ноотроп снизил количество TUNEL-положительных клеток и флуоресцентных клеток DCF-DA [1].

Рисунок 1: Изменения в (A) жизнеспособности клеток, (B) SOD1, (C) SOD2, (D) TNF-альфа, (E) IL-6, (F) IL-10, (G) COX-2, (H) NLRP3, (I) Caspase-1 и (J) IL-1 бета

Для части исследования in vivo испытуемые были разделены на 3 группы по 20 мышей, каждая из которых представляла собой контрольную группу, перенесшую ложную операцию, группу, у которой была вызвана ЧМТ, и экспериментальную группу, у которой была вызвана ЧМТ и которую лечили оксирацетамом. У мышей было получено несколько образцов, и были выполнены процедуры для оценки эффектов ноотропа на РНК и белок, окрашивание IF, BWC и окрашивание TTC. Результаты, полученные из этих образцов и дополнительной визуализации, показали, что травмированный мозг испытал значительную потерю кортикальных тканей после индукции ЧМТ. Однако у испытуемых, лечившихся оксирактамом, наблюдалось заметное снижение объема кортикальной ткани, потерянной после ЧМТ.

В дополнение к снижению потери кортикальной ткани, оксирацетам также смог снизить ипсилатеральную потерю объема кортикального слоя и отек мозга по сравнению с другими группами испытуемых. Эти результаты были получены с помощью окрашивания срезов мозга TTC. Введение ноотропа также снизило количество FJB-позитивных и TUNEL-позитивных клеток, а также уровни COX-2 NLRP3, каспазы-1 и IL-1 бета мРНК и экспрессии белка. Из всех протестированных уровней NLRP3 продемонстрировал наибольшую разницу между испытуемыми с индуцированной ЧМТ, которые получили или не получили введение ноотропа [1].

Рисунок 2: Изменения в (C) содержании воды в мозге и площади потери мозговой ткани, (E) COX-2, (F) NLRP3, (G) Caspase-1 (H) IL-1 beta

При рассмотрении результатов тестов когнитивных функций, проведенных мышами, данные показывают, что после индукции ЧМТ мыши продемонстрировали значительное ухудшение уровней производительности в тесте NOR, что указывает на нарушение кратковременной памяти. При введении оксирацетама все баллы за новый объект C1 значительно увеличились. Кроме того, результаты теста Y-лабиринта показали, что после индукции ЧМТ наблюдались нарушения пространственной памяти. Это нарушение было уменьшено при введении оксирацетама. Наконец, после ЧМТ время ожидания, которое требовалось испытуемым для нахождения скрытой платформы в водном лабиринте Морриса, было заметно увеличено, однако после лечения ноотропом было обнаружено, что время ожидания значительно сократилось [1].

Рисунок 3: Результаты тестов когнитивных функций, включая NOR, Y-образный лабиринт и водный лабиринт Морриса.

2) После выполнения лигирования правой сонной артерии каждого испытуемого результаты этой части исследования показали, что ипсилатеральное полушарие мозга было заметно отечным через 3 дня после инсульта. Было обнаружено, что лечение оксирацетамом облегчает отек после инсульта в зависимости от дозы. Кроме того, анализ, проведенный с помощью окрашивания TTC, показал, что после гипоксически-ишемического инсульта наблюдалось большое ядро инфаркта, которое значительно уменьшилось после лечения ноотропом. Эти выводы были подтверждены данными, полученными с помощью окрашивания нейронов по Нисслю и МРТ-ангиографии, которые подчеркнули уменьшение отека мозга и ишемического инфаркта после введения доз 1 мг/кг и 10 мг/кг оксирацетама [2].

Исследовательская группа также завершила тестирование рефлексов после гипоксически-ишемического инсульта. По сравнению с контрольной группой, испытуемые, перенесшие инсульт без ноотропного лечения, испытали увеличение оборота конечности с течением времени. Однако это измерение времени было значительно сокращено в экспериментальных группах, которым вводили Оксирацетам после того, как произошел инсульт. Результаты отрицательного рефлекса геотаксиса имели схожие результаты, что мышам, перенесшим инсульт без дополнительного лечения, потребовалось больше времени, чтобы повернуться на 180 градусов и подняться на вершину пандуса. Опять же, измерение времени было резко сокращено у мышей, получавших лечение ноотропом. Наконец, результаты, полученные из рефлекса избегания обрыва, соответствовали выпрямительному рефлексу и отрицательному рефлексу геотаксиса, где время до завершения увеличивалось после инсульта и уменьшалось при введении Оксирацетама.

Было также обнаружено, что гипоксически-ишемический инсульт вызывает воспалительную реакцию, которая приводит к дальнейшим воспалительным реакциям и повышенному апоптозу клеток. При этом исследовательская группа провела анализ TUNEL для определения общего количества апоптотических клеток, присутствующих после инсульта. У нелеченых экспериментальных мышей в ипсилатеральном полушарии мозга оставалось значительно меньше клеток. Кроме того, это связано с уровнем TUNEL-позитивных клеток, который также резко увеличился у мышей, пострадавших от гипоксически-ишемического инсульта, по сравнению с контрольной группой. Было показано, что апоптоз снижается дозозависимым образом в пораженной коре головного мозга после лечения оксирацетамом [2].

Кроме того, анализ Western Blot использовался для наблюдения за экспрессией расщепленной каспазы-3. Было обнаружено, что уровни каспазы-3 повышаются после гипоксически-ишемического инсульта, однако эти повышенные уровни были значительно нейтрализованы после лечения оксирацетамом. Уровни расщепленной каспазы-3 были окрашены NeuN и дважды иммунофлуоресцентно помечены для проверки уровня и типа апоптотических нейронов, присутствующих после инсульта. Количество этих дважды положительных нейронов было выше в ипсилатеральных полушариях мышей, прошедших лечение. Было показано, что количество дважды положительных нейронов и общая потеря нейронов снижаются в зависимости от дозы после лечения оксирацетамом.

Как уже упоминалось ранее, микроглия имеет тенденцию быть сверхактивной в незрелом мозге после гипоксически-ишемического инсульта. Анализ вестерн-блоттинга показал, что экспрессия Iba1 была значительно увеличена после инсульта без лечения оксирацетамом. В экспериментальных группах, которым вводили различные дозы ноотропа, уровни Iba1 значительно снижались в зависимости от дозы. Кроме того, было показано, что лечение оксирацетамом резко уменьшило область повреждения, окружающую ядро инфаркта, полутень. Важно отметить, что при дозе ноотропа 1 мг/кг полутень была значительно сужена, а при дозе ноотропа 10 мг/кг полутень почти полностью исчезла [2].

На основании улучшающего эффекта, который оксирацетам оказал на полутень, исследовательская группа смогла сделать вывод, что оксирацетам играет важную роль в спасении области, окружающей ядро инфаркта, и подавлении чрезмерной активации микроглии. Кроме того, анализ LUMINEX использовался для идентификации воспалительных цитокинов после гипоксически-ишемического инсульта. Было показано, что лечение ноотропом снижает уровни IL-1 бета, IL-6 и TNF-альфа. Результаты ОТ-ПЦР также показали, что экспрессия мРНК iNOS и COX-2 снизилась при лечении оксирацетамом. Что касается лечения кислородно-глюкозной депривацией, было обнаружено, что ноотроп дозозависимо увеличивает жизнеспособность клеток в поврежденных областях [2].

Рисунок 4: Изменения воспалительных цитокинов: A) ИЛ-1 бета, B) ИЛ-6, C) ФНО-альфа, D) ИЛ-4, E) ИЛ-10, F) iNOS, G) ЦОГ-2; в ответ на лечение оксирацетамом.

Список источников

[1] Youn DH, Han SW, Kim JT, Choi H, Lee A, Kim N, Jung H, Hong EP, Park CH, Lee Y, Cho SM, Jeon JP. Oxiracetam alleviates anti-inflammatory activity and ameliorates cognitive impairment in the early phase of traumatic brain injury. Acta Neurochir (Wien). 2023 Aug;165(8):2201-2210. doi: 10.1007/s00701-023-05674-8. Epub 2023 Jun 29. PMID: 37380907.

[2] Wang D, Wei Y, Tian J, He D, Zhang R, Ji X, Huang X, Sun J, Gao J, Wang Z, Pang Q, Liu Q. Oxiracetam Mediates Neuroprotection Through the Regulation of Microglia Under Hypoxia-Ischemia Neonatal Brain Injury in Mice. Mol Neurobiol. 2021 Aug;58(8):3918-3937. doi: 10.1007/s12035-021-02376-z. Epub 2021 Apr 22. PMID: 33886092.